CONTEXTE– Notre recherche a pour objectifs la détermination des propriétés structurales et fonctionnelles des polysaccharides bioactifs glycosaminoglycanes (GAGs), de leur analogues d’origine algale et de leurs mimes chimiques [ANR HomeoGAG, 2022], et la compréhension de leurs mécanismes d’action vis-à-vis de cascades biologiques et de protéines partenaires (immunité innée dans le système du complément humain, chimiokines, inflammation). Le Vivant repose pour son fonctionnement sur les propriétés structurales et fonctionnelles de grandes familles de biopolymères, parmi lesquelles celle des polysaccharides exposés à la surface cellulaire ou constituant des glyco-conjugués avec les protéines reste encore mal connue. Cantonnés aux rôles structural et de soutien, les polysaccharides ont gagné depuis peu leur place dans le concert des acteurs biomoléculaires du Vivant, soulevant toutes une séries de questions sur les bases structurales et les mécanismes moléculaires de leurs propriétés fonctionnelles.
AXE STRUCTURAL– Le progrès des connaissances dans ce domaine nécessite de lever des verrous analytiques en particulier pour la caractérisation structurale et le séquençage de séquences glucidiques bioactives, dont les méthodes font aujourd’hui encore défaut. Nous adressons ces défis par une approche pluridisciplinaire à l’interface de la chimie, de la physique et de la biologie. Nous exploitons en particulier les fortes potentialités de la spectrométrie de masse (MS) dans le domaine de la glycobiologie, et ses couplages avec la mobilité ionique [Rapid Commun. Mass Spectrom. 2017], la chromatographie [HAL] et la spectroscopie UV et infra-rouge [Curr. Opin. Struct. Biol. 2018] afin de décoder le contenu informationnel porté par les séquences bioactives. Cet alphabet à déchiffrer repose des déterminants structuraux – entre autres : distribution de groupes sulfate, anomèrie, épimérisation – conduisant à une syntaxe isomérique d’une complexité considérable. Nous étudions également la lecture de ces séquences à l’échelle de la molécule unique en exploitant les propriétés de confinement de nanopores biologiques [ACS Nano 2012], à l’image des procédés de séquençage par nanopore existant déjà pour les acides nucléiques. Nous montrons que des séquences oligosaccharidiques de GAGs peuvent être analysées et distinguées par cette méthode nanopore [Eur. Phys. J E Soft Matter. 2018].
AXE FONCTIONEL– L’élucidation structurale de séquences glucidiques bioactives est le préalable à l’établissement de relations structure/activité. En particulier, afin de mieux comprendre les mécanismes d’interaction et de formation de complexe non-covalents glucide-protéine, nous développons les couplages entre l’électrophorèse capillaire d’affinité et la MS électrospray (ACE-MS), et entre la résonnance plasmonique de surface par imagerie et la MS MALDI (SPRi-MS) [Antibody Arrays, Methods and Protocols, Springer US 2020], ces deux méthodes étant « label-free » et particulièrement adaptées aux complexes protéine-glucide [Anal. Bioanal. Chem. 2020]. Ces couplages MS permettent d’identifier des séquences glucidiques liantes et de caractériser les complexes non-covalents formés (stœchiométrie, constantes thermodynamiques). Du côté du partenaire protéique, nous étudions les processus d’oligomérisation et de modifications conformationnelles engendrés par la liaison d’une séquence glucidiques. Comme pour le défi d’analyse structural, celui posé par la formation de ces complexes glyco-protéique non-covalents nécessite des approches innovantes. Celle que nous développons avec le marquage résolu en temps par rayonnement synchrotron et analyse MS permet de cartographier finement la surface protéique exposée au solvant et d’identifier sur la protéine en solution les domaines impliqués dans la liaison du ligand oligosaccharidique [J. Synchr. Rad. 2017].
Nous complétons ce dispositif d’étude fonctionnelle, par la caractérisation d’enzymes agissant sur les oligo/polysaccharides de GAGs telles que les enzymes humaines sulfatases HSulfs [Biochem. Biophys. Rep. 2019] et polysaccharidase hyaluronidase [Glycobiology 2021], et bactérienne CS 4-O-sulfatase [Biochem. J. 2020] qui se révèlent des outils précieux d’exploration structurale et fonctionnelle [ANR Sulf@as, 2022].
L’ensemble de ces travaux s’appuie sur le riche plateau instrumental du LAMBE comprenant la plate-forme de spectrométrie de masse (7 instruments et ses couplages LC, EC et SPR) labelisée Génopole, les dispositifs nanopore et l’imagerie AFM, ainsi que sur les lignes de lumière METROLOGIE, et DISCO du Synchrotron SOLEIL.